Введение. Бесплодие является значимой проблемой общественного здоровья, так как не позволяет реализовать одну из основных функций организма – воспроизведение потомства. По некоторым оценкам, от 8,2 до 19,6% супружеских пар в России не имеют детей [1], что вносит существенный вклад в ухудшение демографических показателей. В 30–60% случаев бесплодие в браке связано с мужским фактором [2, 3]. Многочисленные исследования, проведенные на рубеже XX–XXI вв., привели к прогрессу в понимании причин мужского бесплодия и роли генетических механизмов в регуляции сперматогенеза [4]. Формирование мужских половых клеток происходит при участии более 2000 генов [5]. Под их контролем находятся процессы деления первичных половых клеток гоноцитов, протекающие еще в эмбриогенезе, дифференцировка сперматогониев, которые начинают активно делиться во время полового созревания, а также образование сперматоцитов, дважды претерпевающих деление во время мейоза.
В ряду разнообразных причин мужского бесплодия условно выделяют экзогенные и эндогенные факторы риска [6, 7]. К числу последних относят соматическое, психологическое и сексуальное здоровье мужчин [8]. К той же группе факторов можно отнести гены, кодирующие ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков.
Система детоксикации ксенобиотиков представляет собой сложный многоступенчатый процесс, включающий две фазы [9]. Гены семейства глутатион-S-трансфераз (GST) принимают участие во второй фазе процесса биотрансформации, частотные характеристики этих полиморфных генов имеют этнические и популяционные особенности. Показано, что наличие неблагоприятных аллелей и генотипов генов GST может вносить вклад в развитие мультифакториальной патологии [10]. В частности, выявлено, что аллели со сниженной функциональной активностью генов GST ассоциированы со снижением фертильных показателей спермы [11]. У мужчин с бесплодием и нефункциональными генотипами GST наблюдаются изменения в показателях, характеризующих активность компонентов системы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты [12, 13].
Система глутатион-S-трансфераз включает шесть классов генов, из которых наиболее изученными к настоящему моменту являются GSTM, GSTT, GSTP. Семейства GSTM, GSTT состоят из кластера генов, а в семействе GSTP один ген и, соответственно, один фермент GSTP1 (глутатионтрансфераза класса пи-1). Ген GSTP1 локализован на длинном плече 11-й хромосомы (11q13.2) и имеет несколько полиморфных вариантов [14]. Один из полиморфизмов гена GSTP1 связан с заменой нуклеотидов аденина на гуанин в 313-м положении гена, вследствие чего при синтезе фермента происходит замена аминокислоты изолейцин на валин в 105-м положении пептида – Ile105Val или A313G полиморфизм (rs1695). Другой полиморфизм гена GSTP1 связан с нуклеотидной заменой цитозина на тимин в 341-м положении гена, в результате чего при синтезе фермента в 114-м положении происходит замена аминокислоты аланин на валин – Ala114Val или C341T полиморфизм (rs1138272). Обе аминокислотные замены находятся в активном центре фермента и приводят к значительному снижению его функциональной активности. В свою очередь снижение активности ферментов глутатионтрансфераз, которые участвуют в метаболических реакциях, направленных на снижение активности чужеродных для организма веществ, может приводить к нарушениям процесса сперматогенеза и как следствие – к формированию бесплодия у мужчин.
Цель настоящего исследования: установить ассоциацию двух полимoрфных локусов Ile105Val, Ala114Val гена GSTP1 (глутатионтрансфераза класса пи-1) с бесплодием у русских мужчин.
Материалы и методы. Были сформированы две группы мужчин репродуктивного возраста: основная (инфертильные) и контрольная (фертильные). Основную группу составили 160 русских мужчин (средний возраст – 30,2±3,6 года), обратившихся в Республиканский перинатальный центр МЗ РБ Улан-Удэ с проблемой бесплодия в браке. Для диагностики мужского бесплодия проводили исследование эякулята двукратно с минимальным интервалом 2 нед., согласно Руководству ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята и сперм-цервикального взаимодействия. Диагноз бесплодие установлен согласно рекомендациям ВОЗ (2010) [15] на основании анамнеза, данных клинического осмотра, результатов гормонального исследования, микроскопии и ПЦР соскоба из уретры, спермограммы, анализа секрета простаты, УЗИ половых органов. Контрольную группу составили 104 практически здоровых русских добровольца с реализованной репродуктивной функцией и нормозооспермией (средний возраст – 31,3±5,4 года). Исследования проведены с информированного согласия обследуемых мужчин в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (Бразилия, 2013).
Молекулярно-генетическое исследование полиморфизмов Ile105Val (rs1695), Ala114Val (rs1138272) гена GSTP1 проводили с помощью метода ПЦР в режиме реального времени. Материалом для исследования служили пробы ДНК, полученные из образцов цельной венозной крови, забор которой осуществлен из локтевой вены в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3. Для экстракции ДНК использовали наборы реагентов «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия). Амплификацию специфичных участков ДНК проводили на амплификаторе нуклеиновых кислот «ДТ-Прайм» («ДНК-Технология», Россия) с использованием тест-систем «Набор реагентов для определения полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 (rs1695)» и «Набор реагентов для определения полиморфизма Ala114Val гена GSTP1» (rs1138272) («Синтол», Россия). Процедуру экстракции ДНК и амплификацию нуклеотидных последовательностей осуществляли согласно рекомендациям производителей соответствующих наборов реагентов.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Biostat и STATISTICA, версия 6.1 (StatSoft Inc., США [правообладатель лицензии ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека»]). Для описания количественных признаков использовали среднее (μ) и стандартное отклонение (σ). При анализе частотного распределения изученных полиморфизмов фактическую частоту генотипов проверяли на соответствие частотам аллелей, исходя из закона генетического равновесия Харди–Вайнберга. При сравнении частот генотипов между группами исследования использовали критерий χ², при сравнении долей – z-критерий. Нулевую гипотезу об отсутствии статистически значимых отличий отклоняли при уровне значимости 5%.
Для оценки вероятности обнаружения рискового генотипа полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 в группе пациентов с бесплодием рассчитывали величину отношения шансов (odds ratio, OR) с указанием 95% доверительного интервала (95% CI). Полученные значения оценивали следующим образом: OR>1 – наличие фактора риска в группе с наличием исхода, OR=1 – отсутствие фактора риска, OR <1 – фактор риска имеет обратную связь с вероятностью исхода. Для решения вопроса о статистической значимости полученного значения OR оценивали величину доверительного интервала: если оба значения CI>1 или <1, выявленная связь между наличием фактора риска и исходом статистически значима, если CI включает единицу, различия между группами не имеют статистической значимости.
Результаты. Проведено молекулярно-генетическое исследование двух полиморфных локусов Ile105Val, Ala114Val гена GSTP1 в группах русских мужчин: фертильных и инфертильных. В обеих группах были выявлены носители всех возможных генотипов (см. таблицу).
Исходя из представления о том, что в популяциях частоты генотипов и аллелей находятся в равновесном соотношении, нами была проведена оценка частотных характеристик изученных полиморфных локусов на соответствие закону Харди–Вайнберга. Обнаружено, что в основной группе инфертильных мужчин распределение частот генотипов соответствовало ожидаемому как для локуса Ile105Val (χ²=2,29; df=1; p>0,05), так и для локуса Ala114Val (χ²=0,07; df=1; p>0,05). В контрольной группе мужчин для локуса Ala114Val также соблюдалось равновесие Харди–Вайнберга (χ²=0,45; df=1; p>0,05), а для локуса Ile105Val наблюдалось незначительное отклонение от данного равновесия (χ²=6,42; df=1; p<0,05), вызванное недостатком гетерозигот.
Сравнительный анализ частотных характеристик двух полиморфных локусов гена GSTP1 выявил, что группы фертильных и инфертильных мужчин статистически значимо различались по частоте генотипов полиморфизма Ile105Val (р=0,024). В группе мужчин с бесплодием частота генотипа дикого типа Ile/Ile была на 13% больше (χ²=3,995; df=1; p=0,046), а частота генотипа гомозиготного по минорной аллели Val/Val – на 6% меньше (χ²=4,887; df=1; p=0,027) по сравнению с группой фертильных мужчин. Изученные выборки также различались по частоте аллелей полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 (z=2,778; p=0,005). Так, частота минорного аллеля Val в группе мужчин с бесплодием составила 19%, в группе фертильных мужчин она оказалась выше – 30%. Таким образом, полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что Ile105Val-полиморфизм гена GSTP1 ассоциирован с мужским бесплодием, генотип Ile/Ile может служить фактором риска, так как статистически значимо чаще наблюдался в группе инфертильных мужчин.
Для количественной оценки связи между рисковым генотипом и бесплодием в группе инфертильных мужчин был рассчитан показатель отношения шансов (OR). Обнаружено, что в группе инфертильных мужчин вероятность обнаружения Ile/Ile-генотипа полиморфизма Ile105Val-гена GSTP1 в 1,7 раза выше (OR=1,73; 95% CI – 1,04–2,87; p<0,05), чем в контрольной группе.
Обсуждение. Мужское бесплодие – широко распространенная проблема, особенно в развитых странах мира [16]. В настоящее время прослеживается тенденция к снижению показателей, характеризующих нормальный сперматогенез, главным образом в результате сложного взаимодействия генетических и экологических факторов среды в условиях ухудшения экологической ситуации [6]. Показано, что глутатион-S-трансферазы, участвующие в процессах детоксикации и антиоксидантной защите, вовлечены в патогенез различных заболеваний [17]. Гены антиоксидантной системы играют важную роль в сперматогенезе, генетические нарушения в генах глутатион-S-трансфераз приводят к снижению фертильных свойств эякулята, которые проявляются такими патологическими состояниями, как олигозооспермия и олигоастенотератозооспермия [18]. Мутации и полиморфные варианты в GST-генах изменяют экспрессию ферментов глутатионтрансфераз, что в свою очередь может быть связано с риском формирования мужского бесплодия [19–21].
Многочисленными исследованиями показано, что нулевые или делетированные генотипы GSTM1, GSTT1 ассоциированы с повышенным риском мужского бесплодия [19, 22–24]. Это было подтверждено результатами мета-анализа, проведенного в 2012 г., объединившего 11 независимых исследований, в которых общая выборка мужчин с бесплодием составила 1323 человека и 1054 случая контроля.
В исследовании было показано, что вероятность бесплодия больше в 2,7 и 1,5 раза среди мужчин с нулевыми генотипами GSTM1 (OR=2,74; 95% CI 1,72–3,84; p=0,003) и GSTT1 (OR=1,54; 95% CI: 1,43 – 3,47; p=0,02) соответственно [25].
В то время как роль делеционных полиморфизмов генов GSTM1, GSTT1 в формировании мужского бесплодия подтверждается многочисленными исследованиями, данные о роли гена GSTP1 противоречивы. Часть авторов не находят ассоциации между Ile105Val-полиморфизмом гена GSTP1 и риском бесплодия [26, 27]. Другие исследователи рассматривают генотипы с минорной аллелью Val в качестве рисковых [21, 28]. В то же время есть работы, в которых показан риск бесплодия для генотипа дикого типа Ile/Ile, а генотипам с минорной аллелью Val, напротив, отводят защитную роль [19, 25].
Согласно данным, полученным в нашем исследовании, частота генотипа дикого типа Ile/Ile и мажорной Ile-аллели полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 значимо больше в группе мужчин с бесплодием. В группе инфертильных мужчин вероятность обнаружения Ile/Ile-генотипа в 1,7 раза выше, чем в контроле. Полученные в нашем исследовании результаты об ассоциации гомозиготного генотипа Ile/Ile полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 с бесплодием у русских мужчин согласуются с результатами других исследований, проведенных на европейских и азиатских выборках [19, 25].
Исследование по типу случай–контроль, включившее 166 мужчин с идиопатической олигоастенотератозооспермией и равное количество фертильных мужчин, показало, что генотип дикого типа Ile/Ile гена GSTP1 в сочетании с нулевым GSTM1- или GSTT1-генотипом увеличивал вероятность бесплодия в 2,5 и 2,7 раза соответственно. В то же время генотипы, включающие минорную аллель Ile/Val, Val/Val, были ассоциированы со значительным снижением риска бесплодия (OR=0,44; 95% CI: 0,29–0,78; p=0,004) [19]. Данные о защитной роли гетерозиготного Ile/Val-генотипа были подтверждены еще в одном исследовании результатами объединенного анализа, включившего 11 независимых исследований (OR=0,48; 95% CI: 0,27–0,77) [25].
Однако авторы другого исследования случай–контроль получили противоположные результаты, их исследование включило 361 мужчину с идиопатической азооспермией, 118 с идиопатической олигоспермией и 234 здоровых фертильных мужчины. Была установлена достоверная связь между генотипами Ile/Val, Val/Val гена GSTP1 и риском идиопатического бесплодия (OR=1.53; 95% CI: 1,11–2,11; p=0,009) [21]. Эти данные подтверждают результаты еще одного исследования, в котором оценивался совместный вклад полиморфизмов GSTM1, GSTT1, GSTP1 и курения в риск идиопатического бесплодия у русских мужчин. Показано, что генотип Ile/Val ассоциирован с риском мужского бесплодия (OR=1,5; 95% CI: 1,02–2,20; p=0,04), в то время как генотип дикого типа в комбинации с нулевым генотипом GSTT1 был связан со снижением риска мужского бесплодия (p<0,003) [28].
Между тем часть исследователей не находят ассоциации между генотипами гена GSTP1 и риском мужского бесплодия. Так, недавний мета-анализ, проведенный в 2017 г., не подтвердил ассоциации полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 c риском мужского бесплодия [26]. Мета-анализ включил 9 исследований, которые объединили 3282 случая мужского бесплодия и 3268 человек из контроля. Авторы отмечают, что в 5 исследованиях не было показано ассоциации между полиморфизмом Ile105Val гена GSTP1 и мужским бесплодием, в 3 исследованиях сообщалось о повышенном риске и в одном – о снижении риска мужского бесплодия.
Результаты мета-анализа об отсутствии ассоциации между Ile105Val-полиморфизмом гена GSTP1 и риском мужского бесплодия также подтверждают результаты другого исследования, в котором была проведена оценка роли генов GST в изменении показателей, характеризующих антиоксидантный уровень спермы и хроматиновый статус сперматозоидов. Авторами не обнаружено статистически значимых различий в частотах генотипов Ile105Val полиморфизма гена GSTP1 в группах мужчин с нормозооспермией и олигоастенотератозооспермией. Показано, что варианты генотипа гена GSTP1 не оказывают влияния на концентрацию и подвижность сперматозоидов, целостность и зрелость хроматина сперматозоидов, суммарное содержание антиоксидантов в сперме и активность глутатионтрансфераз [27].
Противоречивые результаты исследований о роли полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 в идиопатическом мужском бесплодии могут быть объяснены этническими различиями в ген-генных взаимодействиях и взаимодействиях ген–окружающая среда. В частности, большинство исследований об ассоциации полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 были проведены в азиатских популяциях, преимущественно в Китае. Кроме того, мужское бесплодие является гетерогенным заболеванием с многофакторной этиологией, поведенческие и социальные факторы также вносят вклад в формирование бесплодия у современных мужчин [29, 30].
Таким образом, наблюдаемые положительные ассоциации между полиморфизмом Ile105Val гена GSTP1 и риском мужского бесплодия в настоящее время следует интерпретировать с осторожностью. Необходимы дальнейшие исследования для уточнения вклада этого полиморфизма в патогенез мужского бесплодия. Дальнейшее изучение этого вопроса с участием большего спектра популяций может прояснить вопрос о роли полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 в формирование бесплодия у мужчин.
Заключение. Полученные нами результаты позволяют утверждать, что бесплодие у русских мужчин не ассоциировано с полиморфизмом Ala114Val, но ассоциировано с полиморфизмом Ile105Val гена GSTP1. В нашем исследовании показано, что у инфертильных мужчин генотип дикого типа и мажорный аллель Ile встречаются статистически значимо чаще, чем в группе контроля. В группе мужчин с бесплодием вероятность обнаружения генотипа Ile/Ile в 1,7 раза выше. Таким образом, полиморфизм Ile105Val гена GSTP1 может вносить вклад в формирование репродуктивных нарушений у мужчин.
