Варикоцеле является одной из главных причин мужского фактора бесплодия [1]. Его распространенность среди мужчин взрослого возраста в целом составляет порядка 15% [2], а среди мужчин с первичным и вторичным бесплодием – 35% и 80% соответственно [3]. Микрохирургическая варикоцелэктомия у пациентов с мужским фактором бесплодия приводит к улучшению параметров спермограммы и повышению фертильности мужчин [4, 5]. Однако информация о том, что 80% пациентов с варикоцеле не являются бесплодными [6], и о том, что наступление самостоятельной беременности в браке происходит только в 36,4–65% случаев после перенесенной варикоцелэктомии [7, 8], приводит к необходимости тщательного отбора бесплодных мужчин с варикоцеле к хирургическому лечению. В настоящее время лабораторная диагностика мужского бесплодия у пациентов с варикоцеле сводится к стандартной спермограмме с определением концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, а также к оценке гормонального профиля [9]. Кроме того, все активнее применяются на практике продвинутые спермиологические тесты, такие как оценка оксидативного стресса [10, 11], определение фрагментации ДНК сперматозоидов [12, 13], тест на акросомальную реакцию и HBA-тест [14]. Данные анализы эякулята повышают чувствительность оценки репродуктивного потенциала мужчины, однако они не способны указывать на наличие причинно-следственной связи варикоцеле с нарушением сперматогенеза.
Развитие современных методов т.н. омики, в особенности протеомики, произвело революцию в области молекулярной биологии эякулята [15]. Протеомика – достаточно новое направление, которое позволяет проводить идентификацию и количественный анализ белков в клетках, тканях и биологических жидкостях [16]. Однако попытки по изучению белков спермы известны еще с 1938 г. Так, самые ранние исследования показали, что эякулят человека содержит белки, также присутствующие в крови [17, 18]. Фактически биохимические методы, используемые для изучения состава крови, применялись и в отношении эякулята человека и животных, а точные методы разделения и очистки белков позволили получить первоначальное представление о протеоме спермы еще до появления термина «протеомика» [19]. Поскольку эякулят состоит на 5% из секрета яичек, содержащего сперматозоиды, и на 95% – из выделений добавочных половых желез, которые формируют семенную плазму, последней уделяется особое внимание в изучении ее молекулярного состава [20]. Известно, что семенная плазма крайне важна в процессе естественного оплодотворения, поскольку защищает сперматозоиды во время их прохождения через женские половые пути, играя важную роль в выживании, функционировании, подвижности и жизнеспособности сперматозоидов, а также в успешном оплодотворении [21].
В частности, белки семенной плазмы способны связываться и сливаться с мембраной сперматозоида, регулируя его выживаемость после эякуляции [22], подвижность [23, 24], капацитацию [25], акросомальную реакцию и взаимодействие с ооцитом [26]. При варикоцеле все эти функции сперматозоидов могут нарушаться, что отражается в виде изменения экспрессии белков семенной плазмы по данным протеомного анализа [27, 28].
Общие характеристики протеома семенной плазмы
Семенная плазма содержит множество внеклеточных и внутриклеточных белков со средней общей их концентрацией от 35 до 55 г/л [20]. Основная часть белков семенной плазмы — это спермадгезины, богатые цистеином секреторные белки (CRISPs), белки, несущие домены фибронектина II типа, и ферменты [29]. Около 70% белков, содержащихся в семенной плазме, секретируются семенными пузырьками, среди них важные для коагуляции спермы белки семеногелин-1 (SEMG1) и семеногелин-2 (SEMG2), а также лактотрансферрин (LTF) и фибронектин (FN1) [30]. На 20% протеом семенной плазмы представлен белками предстательной железы, среди них три основных белка, регулируемых гормонами: простатспецифический антиген – KLK3, важный для разжижения спермы, простатическая кислая фосфатаза и бета-микросеминопротеин, а также белками бульбоуретральных желез, в основном муцинами [31, 32]. Оставшиеся 10% белков семенной плазмы имеют тестикулярное или эпидидимальное происхождение [33]. Также было показано, что в семенной плазме присутствуют белки, связанные с функцией яичек, и белки измененных сперматозоидов из разных отделов репродуктивного тракта мужчин [34, 35]. Таким образом, профиль белков семенной плазмы отражает не только активность мужских половых добавочных желез, но и качество сперматогенеза, дозревание эпидидимальных сперматозоидов и их целостность.
Протеомика семенной плазмы бесплодных мужчин
На сегодняшний день одной из наиболее изученных с использованием протеомного анализа форм мужского бесплодия является азооспермия. Так, в одной из работ сравнили белковый профиль семенной плазмы мужчин с нормальным и нарушенным сперматогенезом [36]. Результаты показали, что в группе пациентов после вазэктомии (обструктивная азооспермия) и с необструктивной азооспермией (синдром клеток Сертоли – SCOS) экспрессия некоторых белков, таких как кластерин, была снижена по сравнению с контрольной группой, что делает их потенциальными биомаркерами нарушенного сперматогенеза. В другой работе для определения вклада яичка и придатка яичка в протеом семенной плазмы человека сравнивали фертильных мужчин и мужчин после вазэктомии [33]. 32 белка были уникально экспрессируемы в фертильной группе (тестикулярные и эпидидимальные белки), а в группе вазэктомии 49 белков были менее экспрессируемы по сравнению с фертильной группой (белки, экспрессируемые из яичек и придатков яичек, а также из других отделов мужских половых путей). Идентифицированные тестикулярные и эпидидимальные белки, такие как экспрессируемый в семенниках белок последовательности 101 (TEX101), выполняют важные репродуктивные функции и могут быть потенциальными биомаркерами обструктивной азооспермии. В следующем исследовании, выполненном той же группой авторов [37], был проведен протеомный анализ семенной плазмы пяти мужчин с необструктивной азооспермией, а полученные результаты сопоставлены с данными своего предыдущего исследования. Сорбитолдегидрогеназа (SORD) была дифференциально экспрессируема в группе вазэктомии и необструктивной азооспермии по сравнению с группой фертильных мужчин и поэтому предложена в качестве потенциального биомаркера в дополнение к белкам NPC2 и PIP, также предложенным в похожем исследовании [38] в качестве биомаркеров необструктивной и обструктивной азооспермии соответственно. Кроме того, была проведена работа по определению биомаркеров разных типов азооспермии и подтипов необструктивной азооспермии (гипосперматогенез, задержка созревания сперматозоидов, синдром клеток Сертоли) [39]. В данном исследовании идентифицировали два белка, ECM1, экспрессируемый в придатках яичка, и TEX101, экспрессируемый в яичках, которые дифференцировали обструктивную и необструктивную азооспермию с высокой специфичностью и чувствительностью. Концентрация TEX101 в семенной плазме отличалась при синдроме клеток Сертоли от других видов необструктивной азооспермии. Эти данные могут повышать точность в дифференциальной диагностике типов азооспермии, снижать необходимость в диагностических биопсиях яичек и улучшать прогноз результатов экстракции сперматозоидов из яичек (TESE).
Для поиска предикторов успешного извлечения сперматозоидов из яичек при необструктивной азооспермии 40 мужчин, перенесших процедуру TESE, были разделены на 2 группы – с успешной экстракцией сперматозоидов и безуспешной [40]. Сравнительный протеомный анализ семенной плазмы позволил идентифицировать дифференциальную экспрессию галектин-3-связывающего белка (LGALS3BP), концентрация которого была значительно выше в группе мужчин с успешным TESE. Работа, в которой сравнивалась экспрессия белков семенной плазмы в четырех разных группах мужчин с нормозооспермией, астенозооспермией, олигозооспермией и азооспермией, показала наличие восьми белков со статистически значимо повышенной экспрессией при азооспермии по сравнению как минимум с одной из других исследованных групп [41]. При этом концентрация одного белка, а именно кислой фосфатазы простаты (PAP), у пациентов с азооспермией была повышена по сравнению со всеми другими группами. Авторы предположили, что идентифицированная в данном исследовании группа белков, особенно PAP, имеет большой потенциал для использования в качестве маркеров азооспермии.
Также проводились исследования по изучению протеомного профиля семенной плазмы у пациентов с другими различными нарушениями сперматогенеза. В работе R. Sharma и соавт. пациенты были разделены на четыре группы в зависимости от концентрации и морфологии сперматозоидов: нормозооспермия, тератозооспермия, олигозооспермия, олиготератозооспермия [42]. Среди идентифицированных уникальных белков три были подавлены в группе тератозооспермии, один в группе олигозооспермии и один в группе олиготератозооспермии, а два белка были избыточно экспрессированы в группах олигозооспермии и олиготератозооспермии по сравнению с группой нормозооспермии. Большинство идентифицированных белков имели внеклеточное происхождение. Сравнительный анализ протеома семенной плазмы мужчин с олигоастенозооспермией и нормозооспермией показал наличие четырех дифференциально экспрессируемых белков [43]. Два из которых, а именно эпидидимальный секреторный белок E1 и галектин-3-связывающий белок, были более чем в 3 раза снижены в семенной плазме мужчин с олигоастенозооспермией, два других, липокалин-1 и пролактин-индуцируемая форма белка, были сверхэкспрессироваными. В другом исследовании сравнивали белки семенной плазмы фертильных доноров и мужчин с астенозооспермией [44]. Было обнаружено, что 45 белков экспрессировались в 3 раза сильней и 56 белков в 3 раза слабее в группе мужчин с астенозооспермией по сравнению с контрольной группой. Большинство из этих белков происходили из придатка яичка и простаты. Данное исследование выявило богатый источник биомаркеров – кандидатов мужского бесплодия и продемонстрировало то, что функциональные нарушения придатка яичка и предстательной железы могут способствовать развитию астенозооспермии.
Был проведен сравнительный анализ протеомного профиля семенной плазмы мужчин с нормозооспермией в зависимости от уровня фрагментации ДНК сперматозоидов [35]. Для этого пациентов разделили на две группы – с низким и высоким процентом фрагментированных сперматозоидов. Результаты протеомики показали, что 30 белков по-разному экспрессируются между группами, из которых 21 белок имел повышенное значение в образцах с высоким уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов. Среди них наблюдались эпидидимальный секреторный белок E3-альфа (EDDM3A) и рибонуклеаза 4 (RNASE4); оба этих белка участвуют в эндорибонуклеазной активности. В последующем исследовании те же авторы изучали протеомный профиль семенной плазмы мужчин с высокой и низкой фрагментацией ДНК сперматозоидов, высокой и низкой целостностью акросом, а также высокой и низкой митохондриальной активностью [45]. Для этого были набраны 156 пациентов с нормозооспермией, ранжированных в соответствии с результатами функционального анализа их сперматозоидов (фрагментация ДНК, целостность акросомы и митохондриальная активность). Всего у пациентов с низкой митохондриальной активностью было снижено 40 и повышено 64 белка. Основные из этих белков были предложены в качестве потенциальных биомаркеров изменений митохондриальной активности сперматозоидов: аннексин-7 (ANXA7), глутатион-S-трансфераза Mu3 (GSTM3) и резидентный белок эндоплазматического ретикулума 44 (ERP44). Эти белки участвуют в акросомальной реакции, целостности митохондрий и защите от окислительного стресса.
В образцах с низкой целостностью акросом было снижено содержание 27 белков и увеличено содержание 49 белков. Из них только один белок был перекрестно подтвержден многомерным статистическим анализом: белок переноса фосфолипидов (PLTP), связанный с реакцией острой фазы. Что касается фрагментации ДНК сперматозоидов, то в группе с высоким уровнем фрагментированных сперматозоидов 108 белков были снижены, а 26 повышены. Единственным белком, предложенным в качестве биомаркера высокой фрагментации ДНК сперматозоидов, была субъединица протеасомы альфа 5-го типа (PSMB5).
Оценивая влияние табака на белковый состав семенной плазмы у мужчин с варикоцеле, было проанализировано три группы пациентов: некурящих, умеренно курящих (<20 сигарет в день) и заядлых курильщиков [46]. Обе группы курильщиков показали снижение качества спермы по сравнению с контрольной группой. Протеомный анализ выявил 20 белков, по-разному экспрессируемых между исследуемыми группами. Такие белки, как аннексин A3 (ANXA3) и внеклеточная супероксиддисмутаза (SOD3), имели дифференциальную экспрессию в группе умеренно курящих, а цинк-альфа-2-гликопротеин (AZGP1) в группе заядлых курильщиков.
Протеомика семенной плазмы и варикоцеле
Поскольку варикоцеле является сложным заболеванием с различными патогенетическими механизмами, которые могут определять бесплодие, меняющий парадигму подход с использованием постгеномных технологий обещает более точное понимание эффекторных путей мужского бесплодия, вызванного варикоцеле, а также прогнозирование результатов его лечения [27]. Первый отчет о протеомике семенной плазмы у пациентов с варикоцеле был опубликован в 2013 г. [28]. В исследовании сравнили протеомный профиль трех групп подростков: без варикоцеле (контрольная группа), с варикоцеле и нормальным анализом спермограммы (ВНС), с варикоцеле и аномальными параметрами спермограммы (ВАС). Белки регуляции апоптоза, такие как SEMG1 и белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP3), были сверхэкспрессируемыми в группе ВАС, и наоборот, белки сперматогенеза, а именно убиквитин-протеинлигаза E3 BRE1B (RNF40), проактиваторный полипептид-подобный 1 (PSAPL1) и эпидидимальный секреторный белок E3-бета (EDDM3B) были сверхэкспрессируемыми в группе ВНС. Контрольные образцы были представлены белками, связанными с гомеостазом. Позже в том же медицинском учреждении было проведено исследование по изучению влияния варикоцелэктомии на протеом семенной плазмы подростков [47]. Авторы определили, что перед варикоцелэктомией сверхэкспрессировались два белка: субъединица ДНК-ориентированной РНК-полимеразы III RPC2 (POLR3B) и отрицательный фактор элонгации E (NELFE). Через 3 мес. после варикоцелэктомии уникально экспрессировались или сверхэкспрессировались 6 белков, а именно SEMG1, SEMG2, ACPP, KLK3, TGM4 и альфа-1-антитрипсин (SERPINA1). Все белки, дифференциально экспрессируемые в постварикоцелэктомической группе, играют решающую роль в процессах коагуляции и разжижения семенной жидкости, соответственно, хирургическое вмешательство по поводу варикоцеле у подростков сдвигает протеом в сторону более физиологичного профиля. К аналогичному выводу пришли также авторы другой работы, выполненной со взрослыми пациентами [27]. При сравнительном протеомном анализе семенной плазмы до и после варикоцелэктомии было идентифицировано и количественно определено 316 белков, из которых 53 белка были сверхэкспрессироваными или уникально экспрессировались у мужчин до варикоцелэктомии, а 38 белков были уникально экспрессируемыми у мужчин после варикоцелэктомии. Функциональный анализ показал, что обе группы были обогащены белками, регулирующими функции связывания и ответа на стимулы, группа до варикоцелэктомии была обогащена белками, регулирующими метаболизм оксида азота и связывание домена тетратрикопептидного повтора (TPR), а группа после варикоцелэктомии – белками, регулирующими ответ на активные формы кислорода, глюконеогенез, связывание никотинамидадениндинуклеотида и стабилизацию белка. Результаты данных исследований говорят о том, что хирургическое устранение варикоцеле способствует возвращению эякулята к физиологическому состоянию. В очередном исследовании с участием подростков оценивалось влияние варикоцеле на уровень белков DNASE1 (дезоксирибонуклеаза-1) и IGFBP7 (белок 7, связывающий инсулиноподобный фактор роста) в семенной плазме [48]. Для этого подростков поделили на группы контроля (без варикоцеле), с варикоцеле и нормозооспермией (ВНС), с варикоцеле и аномальными показателями спермограммы (ВАС). Было показано, что IGFBP7 сверхэкспрессируется в группах подростков с варикоцеле по сравнению с группой контроля, а уровень DNASE1 прогрессивно снижается при варикоцеле (в группе ВАС сильнее, чем в группе ВНС). Уровни DNASE1 положительно коррелировали с концентрацией и морфологией сперматозоидов. Зная роль DNASE1 в регуляции апоптоза, а IGFBP7 в пролиферации клеток, авторы сделали вывод, что начальной реакцией на варикоцеле является увеличение пролиферативной активности и если за ней следует регуляция апоптоза, то это может способствовать сохранению нормального количества сперматозоидов, соответствующего пороговым значениям ВОЗ, но при наличии нерегулируемого апоптоза приводит к снижению концентрации и морфологии сперматозоидов. Кроме того, протеомный анализ, проведенный той же группой авторов, показал, что у подростков из контрольной группы наблюдаются специфические биомаркеры сперматогенеза и гомеостаза, а наличие пальпируемого варикоцеле приводит к обогащению семенной плазмы белками иммунного ответа с развитием хронической воспалительной реакции. Эти изменения отражают нарушения функции яичек, приводящие к снижению качества спермы у подростков с варикоцеле [49]. Еще одна работа продемонстрировала снижение в семенной плазме после варикоцелэктомии уровня богатого цистеином секреторного белка (CRISP-3), участвующего в воспалительной реакции, исходно значительно повышенного в группе взрослых пациентов с варикоцеле по сравнению с конт-рольной группой [50]. При сравнении одно- и двустороннего варикоцеле были выявлены дифференциально экспрессируемые белки (DEP) семенной плазмы, связанные с окислительным стрессом (пероксиредоксин-2; PRDX2), фрагментацией ДНК сперматозоидов (синтаза жирных кислот; FASN) и воспалительной реакцией (фибронектин-1; FN1). Измененное содержание DEP и их связь с ключевыми процессами показали, что гомеостаз семенной плазмы нарушается у пациентов с двусторонним варикоцеле. Кроме того, авторы предложили PRDX2, FASN и FN1 в качестве потенциальных неинвазивных маркеров семенной плазмы для дифференциации пациентов с одно- и двусторонним варикоцеле [51]. В одном из недавних исследований с участием 25 мужчин с варикоцеле оценивался протеомный профиль семенной плазмы до и через 12 мес. после микрохирургической варикоцелэктомии. Пациентов разделили на группу с положительным (улучшение параметров спермограммы) и отрицательным (отсутствие изменений в спермограмме) результатами операции. В двух группах после варикоцелэктомии было идентифицировано 647 белков, из них 151 дифференциально экспрессируемый в группе с отрицательным исходом операции и 30 дифференциально экспрессируемых в группе с положительным исходом. Белок трипептидилпептидаза-1 (TPP1) имел наибольшую прогностическую ценность и был предложен в качестве предиктора исхода варикоцелэктомии у взрослых пациентов [52].
Проведенные немногочисленные исследования показывают, что изменения в белковом профиле семенной плазмы пациентов с варикоцеле наблюдаются не только при нарушенных параметрах спермограммы, но и при нормозооспермии, что может говорить о большей чувствительности протеомного анализа в определении влияния варикоцеле на сперматогенез и функции сперматозоидов по сравнению со стандартной спермограммой. Различие протеомов семенной плазмы одних и тех же мужчин с варикоцеле друг от друга до и после микрохирургической варикоцелэктомии, а также дифференциальная экспрессия белков между пациентами с положительным и отрицательным результатом операции делают возможным использование данного анализа в качестве инструмента для отбора пациентов на хирургическое лечение. Включение протеомного исследования семенной плазмы в перечень диагностических методов определения мужского бесплодия должно улучшать качество оказываемой медицинской помощи пациентам с варикоцеле.
