Введение. Идиопатическим бесплодием считается олиго- и/или астено-, и/или тератозооспермия или азооспермия без очевидных причин, выявляемых при сборе анамнеза, физикальном и гормональном обследовании [1, 2]. Идиопатические нарушения качества спермы – самая частая причина мужского бесплодия, диагностируемая в 30–70% случаев [1, 2].
Не первое десятилетие для лечения мужского бесплодия применяют различные нутриенты-антиоксиданты: витамины Е и С, карнитины, цинк, селен, убихинон и др. [3–7]. В мета-анализе, подготовленном M. Showell et al. [8], показано, что антиоксиданты способны улучшать показатели спермограммы: увеличивать концентрацию и подвижность сперматозоидов, уменьшать фрагментацию их ДНК. Однако авторами мета-анализа отмечен низкий и очень низкий уровень доказательности исследований [8]. В недавно опубликованном мета-анализе R. M. Smits et al. [9] показано, что антиоксиданты, назначаемые мужчине, повышают шанс на беременность и успешные роды. По обобщенным данным, от субфертильных мужчин, не принимавших антиоксидантов, клиническая беременность наступала в 7% случаев против 12–26% в парах, где мужчины принимали антиоксиданты [9]. При этом авторы подчеркивают, что субфертильным парам следует сообщать о неубедительности имеющихся на сегодняшний день доказательств из-за низкого методологического уровня исследований, высокой погрешности результатов ввиду низкой частоты событий, большого числа выбывших из исследований и небольших групп исследований [9]. По мнению авторов обзора, для выяснения возможностей различных антиоксидантов при нарушениях репродуктивной функции мужчин необходимы крупные хорошо спланированные рандомизированные контролируемые исследования. В частности, до сих пор неясно, какие нутриенты-антиоксиданты эффективнее – гидрофильные или липофильные [8, 9].
Цель исследования: сравнить эффективность готового лекарственного комплекса, содержащего преимущественно гидрофильные антиокиданты: L-карнитин, цинк, селен, витамин С, фолиевую кислоту, убихинон и др. (БАД «БЕСТФертил»), с комплексом, содержащим липофильные полиненасыщенные жирные кислоты, главным образом (70%) докозагексаеновую кислоту и витамин Е (БАД «Бруди Плюс») для субфертильных пациентов с идиопатической олиго- и/или астено-, и/или тератозооспермией.
Материал и методы. Проведено клиническое открытое сравнительное рандомизированное проспективное (когортное) многоцентровое. По данным комплексного клинико-лабораторного обследования отобраны 160 пациентов в возрасте 18–45 лет с идиопатическим мужским бесплодием, соответствовавших критериям включения.
Объем необходимой выборки пациентов определялся: 1) минимально необходимой рекомендуемой мощностью исследования в 80% (0,8); 2) минимальным уровнем значимости в 0,05; 3) максимальной величиной стандартизованного различия (standardized difference/Ds) = 0,47, достигнутой в наших предыдущих исследованиях по применению комплексов антиоксидантов [10].
Критерии включения: продолжительность вынужденного бесплодия более 12 мес., идиопатическая олиго- и/или астено-, и/или тератозооспермия по критериям ВОЗ (2010) [11].
Критерии исключения: азооспермия, выраженная олигозооспермия (концентрация сперматозоидов менее 5 млн/мл), установленные генетические факторы бесплодия, концентрация сперматозоидов более 80 млн/мл, иммунный фактор бесплодия (>10% сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами, по данным MAR-IgG-теста), содержание гонадотропинов и/или тестостерона в периферической крови за пределами референсных значений, инфекционно-воспалительные заболевания органов репродуктивной системы, клиническое варикоцеле, эякуляторные нарушения, системные соматические заболевания, психические нарушения; установленный женский фактор бесплодия.
С помощью генератора случайных чисел пациенты были рандомизированы на три группы. Пациенты 1-й группы получали БАД «БЕСТФертил» («Мединторг», Россия) в соответствии с инструкцией 4 капсулы в сутки (по 2 разного состава) в течение не менее 12 нед. Во 2-й группе пациенты получали БАД «Бруди Плюс» («Бруди Технолоджи», Испания) по 3 капсулы в сутки в течение не менее 12 нед. Третью группу составили мужчины, которые не получали лечения, но должны были соблюдать рекомендации по здоровому образу жизни: запрет на тепловые процедуры (баня, сауна), не курить, ограничить потребление алкоголя (не более 30–40 г чистого алкоголя в неделю), сбалансированное питание с достаточным количеством рыбы, орехов, фруктов и овощей. Аналогичные рекомендации были даны пациентам других групп.
График обследования мужчин всех групп: исходно и через 3 мес.
Обследование, которое проводили исходно и через 3 мес. лечения, включало:
- общеклиническое обследование;
- УЗИ простаты и органов мошонки;
- оценку качества эякулята в соответствии с требованиями ВОЗ (2010);
- определение антиспермальных антител (АСАТ) методом MAR%IgG и IgA (SpermMar Kit, FertiPro, Бельгия);
- определение фрагментации ДНК сперматозоидов методом дисперсии хроматина в агарозном геле [12];
- определение содержания гормонов (фолликулостимулирующий гормон, тестостерон и др.) в периферической крови методом хемилюминесценции;
- обнаружение инфекций репродуктивного тракта методами ПЦР, ИФА, посевом на питательные среды.
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ Microsoft Excel и Statistica (StatSoft, США). Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводили по критерию Шапиро–Уилка (Shapiro–Wilk, S–W). Средние значения по группам представляли в виде M±SD, медианы, 25-го и 75-го процентилей, диапазона «невыпадающих значений». На графиках Box-and-whisker «выпадающими» являлись точки, которые находятся далеко от центра распределения и не характерные для него (возможно, являются результатом ошибок наблюдения или выбросами). В нашем случае «выпадающими» оказались значения, рассчитанные в соответствии с алгоритмом, настроенным в статистическом пакете «Statistica» по умолчанию: «контуры» – значения больше, чем интерквартильный размах с коэффициентом х1,5; «пределы» – с коэффициентом х2.
Значимость различий между группами проверяли с помощью критериев Стьюдента (t), Манна–Уитни (Mann–Whitney, M–W), знаков (Z), χ2 и Вилкоксона (Wilcoxon, W); различия считали статистически значимыми при p<0,05. Вычисляли стандартизованное различие наблюдаемых изменений параметров спермограммы и статистическую мощность выполненного исследования.
Чтобы подтвердить отношение значений оцениваемых параметров всех групп к одной генеральной совокупности, сравнивали средние значения по группам по t-критерию и критерию M–W, частоты случаев различных диагнозов (олиго-, астено-, тератозооспремия) – по критерию χ2. Значения каждого показателя в группах до и через 3 мес. лечения сравнивали с использование t-критерия для зависимых выборок (в случае нормального распределения признака) и с использованием критериев W и Z (при ненормальном распределении признака). Чтобы установить статистическую значимость наблюдаемых различий между группами, сравнивали: 1) средние величины этих изменений (Х2–Х1 для n1, n2 и n3 пациентов с учетом знака изменений) по t-критерию для независимых групп; 2) средние ранги значений Х2–Х1 с помощью критерия M–W; 3) частоты случаев улучшения каждого из параметров по критерию χ2.
Все мужчины подписывали информированное согласие на использование данных их обследования в научных целях.
Результаты. Из 160 пациентов, включенных в исследование, контрольное обследование через 3 мес. прошли 143. Причиной неявки 17 мужчин стали: 1) наступившая беременность у жен – 14 человек (по 6 в группах, получавших лечение, и 2 в контрольной), 2) неизвестная причина – 3 человека. Из числа повторно обследованных через 3 мес. лечения еще 10 человек были исключены из-за: 1) диагностированного при повторном визите инфекционно-воспалительного процесса в репродуктивном тракте с пиоспермией – 8 человек, 2) нарушения режима приема назначенных препаратов – 2 человека.
Таким образом, с учетом выпавших случаев сравниваемые группы были представлены 46 пациентами, получавшими «БЕСТФертил», 45 – получавшими «Бруди Плюс» и 42 – контрольная группа. Средний возраст пациентов данных групп составил 33,0±5,7, 34,1±4,9 и 33,9±5,2 года соответственно (p>0,05). Так как снижение качества спермы во всех группах было идиопатическим, различий в особенностях анамнеза и результатах физикального осмотра также не было.
Структура нарушений качества спермы до начала лечения выглядела следующим образом: в 1-й группе олигозооспермия выявлена у 2 (4%) пациентов, астенозооспермия – у 15 (33%), тератозооспермия – у 45 (98%); во 2-й группе – у 1 (2%), 15 (33%), 44 (98%) пациентов; в контрольной группе – у 1 (2%), 16 (39%) и 40 (98%) мужчин соответственно. Статистически значимых различий между группами по средним значениям концентрации, подвижности, морфологии, фрагментации ДНК сперматозоидов, а также по частоте случаев олиго-, астено- или тератозооспермии не было (p>0,05; табл. 1, 2).
В обеих группах лечения в период наблюдения имело место значимое увеличение концентрации сперматозоидов (см. табл. 1). У получавших БАД «БЕСТФертил» среднее по группе увеличение концентрации через 3 мес. составило 7,2 млн/мл (+17,2% по отношению к исходному значению; р<0,05), у получавших БАД «Бруди Плюс» – 14,1 млн/мл (+30,4% к исходному; р<0,05). Поскольку распределение значений концентрации сперматозоидов не во всех группах было нормальным (S–W: контрольной группы – 0,92, p=0,008; «БЕСТФертил» – 0,95, p=0,037; «Бруди Плюс» – 0,96, p=0,19), вычисляли медиану с учетом выпадающих значений. Показано (рис. 1), что у получавших «БЕСТФертил» этот эффект был более выраженным и статистически значимым, чем у получавших «Бруди Плюс»: в первом случае концентрация выросла на 16 млн/мл (р=0,046), по втором – только на 3 млн/мл (р>0,05). Увеличение концентрации в обеих группах констатировали одинаково часто: у 63% (29 из 46) мужчин, получавших «БЕСТФертил», и у 58% (26 из 45) пациентов, получавших «Бруди Плюс» (в обоих случаях по критерию знаков р>0,05). Различия концентрации сперматозоидов между группами, получавшими лечение, и контрольной группой, определяемыми с использованием как параметрических, так и непараметрических критериев, были статистически незначимы (р>0,05; табл. 1, 2).
Процент сперматозоидов с прогрессивной подвижностью за период наблюдения во всех группах менялся разнонаправлено и статистически незначимо (р>0,05); различий между группами не было (р>0,05).
Доля патологических форм сперматозоидов у получавших «БЕСТФертил» за 3-месячный период не изменилась (см. табл. 1, рис. 2А). У мужчин, получавших «Бруди Плюс», наблюдалось незначительное, но статистически значимое улучшение морфологии сперматозоидов (см. табл. 1, рис. 2): процент патологически измененных сперматозоидов, оцениваемых по «строгим критериям», уменьшился на 1,5% для средней и 0,5% для медианы (в обоих случаях р<0,05). Различия между всеми группами по изменению морфологии сперматозоидов статистически незначимы (см. табл. 1, 2; р>0,05).
Процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК не во всех исследуемых группах (табл. 1 и 2, рис. 3) соответствовал нормальному распределению: S–W контрольной группы – 0,92, p=0,20; «БЕСТФертил» – 0,96, p=0,34; «Бруди Плюс» – 0,74, p=0,00001. У получавших «БЕСТФертил» средняя арифметическая уменьшилась на 5,2% (-28,6% исходного; р<0,01); медиана – на 6% (33% исходного; р=0,002), в группе получавших «Бруди Плюс» – на 4,6% (-23% исходного; р<0,01) и 5% (29% исходного; р=0,002) соответственно. Положительную динамику данного показателя несколько чаще регистрировали в группе получавших «Бруди Плюс»: 23 из 29 (79%; р<0,01) против 20 из 31 (65%; р>0,05) в группе получавших «БЕСТФертил». Однако статистически значимых различий ни в величине наблюдаемых изменений, ни в частоте случаев улучшения между группами не было (р>0,05). Значимые различия по данному показателю отсутствовали и при сравнении с контрольной группой (р>0,05), в которой также наблюдалось существенное уменьшение процента сперматозоидов с фрагментацией ДНК (рис. 3; p<0,001).
За период наблюдения беременности наступили в обеих группах лечения одинаково часто – по 6 случаев при 2 случаях в контрольной группе; статистически значимые различия в частоте случаев между всеми тремя группами по критерию χ2 при этом отсутствовали (р>0,05).
Обсуждение. Эффективность лечения идиопатического мужского бесплодия остается дискуссионным вопросом [1–7]. До сих пор не ясно, какое значение имеют при этом гидрофильные или липофильные свойства использованных для лечения нутриентов [8, 9].
Наше исследование было призвано ответить на вопрос: будет ли различаться эффект лечения идиопатического мужского бесплодия в форме олиго-, астено- и/или тератозооспермии при использовании гидрофильных или липофильных нутриентов? К первым относятся карнитины, витамин С, селен, цинк и др., ко вторым – витамин Е, омега-3 жирные кислоты. В качестве лекарственного комплекса с преимущественно гидрофильными компонентами мы применили отечественный БАД «БЕСТФертил». В качестве лекарственного средства с преимущественно липофильными нутриентами – БАД «Бруди Плюс». Состав данных БАД представлен в табл. 3.
В ходе исследования установлено, что за 3-месячный период наблюдения в группах, получавших лечение, произошло статистически значимое увеличение концентрации сперматозоидов. При исходной концентрации примерно в 40 млн/мл (от 5 до 80 млн/мл) у получавших БАД «БЕСТФертил» такое увеличение составило 7,2 млн/мл для средней арифметической и 16 млн/мл для медианы. У принимавших БАД «Бруди Плюс» – 14,1 и 3 млн/мл соответственно. Ds при этом составил 0,32 и 0,36 соответственно, т.е. в целом эффект оказался слабым (величина меньше 0,2 считается отсутствием эффекта, от 0,2 до 0,5 – слабым, от 0,5 до 0,8 – средним и больше 0,8 – сильным эффектом). В контрольной группе значимые изменения концентрации сперматозоидов отсутствовали (Ds<0,2). При этом доля пациентов, у которых наблюдалось увеличение концентрации, в группах лечения составляла примерно 60%. Это означает, что реакция различных пациентов на лечение данными нутриентами была различной: от существенного роста концентрации до полного отсутствия эффекта.
Аналогичные закономерности видны при анализе результатов теста на фрагментацию ДНК. У получавших «БЕСТФертил» среднее значение показателя уменьшилось на 5,2%, медиана – на 6% (Ds=0,61); у получавших «Бруди Плюс» – на 4,6 и 5,0% соответственно (Ds=0,36). Отсутствие улучшения фрагментации несколько реже отмечалось в группе пациентов, получавших «Бруди Плюс», – относительная частота – 0,207 [95% ДИ: 0,080; 0,397] по сравнению с 0,355 [95% ДИ: 0,199; 0,561] в группе получавших «БЕСТФертил». Однако статистических различий ни в величине наблюдаемых изменений, ни в частоте случаев улучшения между группами также не было. Не было различий и по сравнению с контрольной группой, где также наблюдалось существенное уменьшение доли сперматозоидов с фрагментацией ДНК (Ds=0,69).
Хорошие результаты лечения одних пациентов и полное отсутствие эффекта у других, по-видимому, означает, что в отобранных группах пациентов только в части случаев причиной снижения показателей спермограммы был оксидативный стресс (ОС), а именно при ОС мы вправе ожидать положительного эффекта применения нутриентов-антиоксидантов. По мнению M. Showell et al. [8], ОС является ведущим фактором патогенеза мужской фертильности в 30–80% случаев, по нашим ранее опубликованным данным, – примерно в 40% [13]. Кроме того, имеет значение степень выраженности ОС. Недавно нами было показано, что комплексы нутриентов-антиоксидантов улучшают показатели спермограммы при умеренном повышении продукции активных форм кислорода (АФК) в нативной сперме и менее эффективны при высоком содержании АФК.
В отсутствие ОС, когда продукция АФК в нативном эякуляте в норме, антиоксиданты не давали никакого эффекта [10].
Полученные в данном исследовании данные во многом совпадают с результатами опубликованных на эту тему работ.
По данным мета-анализа M. Showell et al. [8], увеличение концентрации сперматозоидов через 3 мес. лечения антиоксидантами составляет в среднем 5,3 млн/мл [95% ДИ: 0,62; 11,26], общей подвижности – 10% [95% ДИ: 3,79; 16,25], уменьшение сперматозоидов с фрагментацией ДНК – 13,85% [95% ДИ: -17,28; -10,42]. Однако последний вывод сделан авторами обзора на основании только 2 рандомизированных контролируемых исследований: по данным E. Greco et al. [14], комбинация витаминов С и Е привела к уменьшению фрагментации ДНК на 13,8% (95% ДИ: -17,5; -10,10), а докозагексаеновая кислота в дозе 1050 мг/сут., по данным J. C. Martinez-Soto [15], – на 14,1% (95% ДИ: -23,22; -4,98). Однако существенным недостатком последнего исследования было малое число обследованных: 21 – в основной группе и 15 – в контрольной [15]. В более позднем рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании [16] не отмечено положительного влияния на фрагментацию ДНК сперматозоидов комплекса нутриентов (карнитины, цинк, селен, витамин С и др.) по сравнению с контрольной группой. Указывают на отсутствие значимого положительного влияния докозагексаеновой кислоты на фрагментацию и другие авторы [17]. По обобщенным данным недавно проведенного мета-анализа R. M. Smiths et al. [9], у тех, кто получал различные антиоксиданты (n=133), уменьшение процента сперматозоидов с фрагментацией ДНК было больше, чем у получавших плацебо (n=121), на 5% (95% ДИ: -12,61; 2,61). Уменьшение на 5–6% фрагментации ДНК сперматозоидов на фоне применения нутриентов соответствует полученным нами данным, но только по отношению к исходным значениям, но не к показателям контрольной группы, поскольку в контрольной группе нормализация образа жизни и исключение влияния гонадотоксичных факторов также привели к существенному улучшению показателя фрагментации ДНК сперматозоидов.
В последние годы вышло несколько отечественных публикаций по применению использованных нами комплексов нутриентов «БЕСТФертил» и «Бруди Плюс» при лечении мужского бесплодия. Их результаты противоречивы, корректность методологии и обоснованность выводов во многих случаях вызывают вопросы.
По данным А. Ю. Поповой и соавт. [18], у пациентов с исходно повышенной фрагментацией ДНК (больше 15% по данным TUNEL) ее уровень на фоне применения БАД «Бруди Плюс» (n=20) через 1,5 мес. снизился с 25,8 до 17,4%, через 3 мес. – до 13,7%, т.е. на 12,1% (почти в 2 раза). В контрольной группе (n=20), пациенты которой получали некую стандартную антиоксидантную терапию (не указаны ни субстанции, ни их дозы), – с 23,5 до 19,8%, т.е. на 5,5% (22% исходной). Позже та же группа авторов опубликовали статью по результатам обследования уже 100 мужчин [19], однако в ней представлены ровно те же значения, что и в первой статье на 40 пациентах: 25,3, 17,4 и 13,7% сперматозоидов с фрагментацией ДНК исходно, через 1,5 мес. и через 3 мес. применения «Бруди Плюс».
Исследованию влияния на фрагментацию ДНК сперматозоидов БАД «БЕСТФертил» посвящены работы Ф. Асфандиярова и соавт. [20], а также С. Гамидова и соавт. [21]. В первом исследовании данный показатель снизился на 9% [20], при этом положительная динамика фрагментации ДНК наблюдалась только в 32% случаев (по нашим данным, в 65% случаев и в среднем на 5%). В этой ситуации непонятно, как в таком случае средний процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК в этой работе мог снизиться с 28 до 19%, если только у 32% пациентов имело место улучшение данного показателя? С. Гамидов и соавт. [21] сообщают, наоборот, о несущественном (с 17,8 до 15%) снижении доли сперматозоидов с фрагментацией ДНК. Авторы тех статей представляют противоречивые результаты и о влиянии «БЕСТФертила» на концентрацию сперматозоидов: статистически значимое увеличение с 18,6 до 27,9 млн/мл в отсутствие изменений в контрольной группе [20] и незначимое (с 42 до 45 млн/мл), по данным другой работы [21]. При этом в обеих цитируемых работах имело место значимое увеличение доли сперматозоидов с поступательным движением и морфологически нормальных форм, чего не наблюдалось в наших исследованиях. Еще более оптимистичные результаты применения «БЕСТФертила» предоставили Д. Г. Кореньков и соавт. [22]: на фоне лечения концентрация сперматозоидов повысилась в 3 раза (39% от показателей контрольной группы), доля сперматозоидов с поступательным движением – в 6 (90% от контрольной), доля патологических форм снизилась на треть (2,9% от контрольной). Однако вряд ли корректно сравнивать изменения в результате лечения с показателями контрольной группой здоровых мужчин, если исходные значения в основной и контрольной группах отличались для концентрации в 7,7 раза, для подвижности в 6,8, для морфологии в 2 раза [22]. Да и сам факт уменьшения процента патологических сперматозоидов на треть вызывает большие сомнения, поскольку морфология – самый трудноисправимый параметр стандартной спермограммы, и даже в цитируемых мета-анализах по применению антиокидантов отсутствуют данные об изменениях морфологии сперматозоидов [8, 9].
Отсутствие значимого положительного эффекта применения использованных комплексов нутриентов в нашем исследовании может быть связано с особенностями сформированных групп, в которых преобладали пациенты с тератозооспермией, природа которой часто обусловлена генетически [23].
В целом вопрос эффективности применения нутриентов при мужском бесплодии остается открытым. Наши данные подтверждают точку зрения авторов Руководства по мужскому бесплодию Европейской ассоциации урологов [1], согласно которой применение нутриентов при идиопатическом мужском бесплодии в настоящее время нельзя считать очевидной опцией и такое лечение не следует назначать всем подряд. Считаем, нутриенты могут быть полезными при дефиците важных биологических субстанций, восполняемом препаратами (например, имеются данные, что карнитины помогают при сниженном содержании карнитинов в сперме) [24]. Такая терапия также оправданна при наличии ОС [25], поскольку большинство применяемых нутриентов (витамины Е и С, коэнзимы, селен, цинк и др.) являются антиоксидантами. Причем положительный эффект, очевидно, достигается в определенном диапазоне избытка свободных радикалов [10]. В связи с этим, для того чтобы назначать такую терапию патогенетически обоснованно, следует шире применять определение различных маркеров ОС в практике андрологических лабораторий [2, 25].
Заключение. Результаты выполненного исследования показывают, что эффекты применения гидрофильных и липофильных нутриентов-антиоксидантов при идиопатическом мужском бесплодии в форме олиго- и/или астено- и/или тератозооспермии сходны. Это проявляется в аналогичных изменениях концентрации и фрагментации ДНК сперматозоидов, проценте наступивших беременностей. Несмотря на позитивную динамику, наблюдаемые изменения статистически значимо не отличаются от результатов обследования пациентов контрольной группы. Нет достаточных оснований утверждать, что нутриенты, как гидрофильные, так и липофильные, эффективны при лечении мужского идиопатического бесплодия. Показанием к такой терапии считаем подтвержденный ОС сперматозоидов. Полученные результаты следует полагать предварительными, поскольку статистическая мощность выполненного исследования оказалась недостаточно высокой (максимально 0,69), что не позволяет исключить ошибку типа 2 – необоснованное отрицание различий.
