Введение. Совершенствование технологии регенеративной медицины связано с широким внедрением в клиническую практику методов клеточной терапии для лечения ряда дегенеративных заболеваний, в том числе и патологии глаза. Достижения в области регенеративной медицины и клеточной терапии основываются на уникальных свойствах стволовых клеток, включая способность к самообновлению и возможность дифференцировки в специфические виды клеток.
Десценция тазового дна представляет собой сложную гинекологическую патологию. По данным зарубежных авторов, частота реконструктивных операций на тазовом дне колеблется от 1,5 до 4,9 случая на 1000 женщин ежегодно [1]. Распространенность пролапса органов малого таза в Российской Федерации у женщин старше 50 лет составляет 40%, и эта патология занимает третье место в структуре показаний к плановому оперативному лечению [2].
Стромально-васкулярная фракция жировой ткани как источник мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) может служить модулятором воспалительных и иммунных реакций и, возможно, участвовать в регенерации поврежденной ткани или увеличивать популяцию эндогенных стволовых клеток, что инициирует реконструкцию [3, 4]. В исследовании [5] не было выявлено достоверных различий в соотношении коллагена I/III типов через 12 нед. при использовании ММСК из пуповинной крови. Интерес представляет исследование Q. Li et al. [6], в котором было показано, что биологические материалы улучшают механические свойства тканей и могут применяться в реконструктивной хирургии. К задачам реконструктивной хирургии относится не только установка протеза, но и обеспечение условий для получения адекватного функционального результата и снижения возможных рисков осложнений в виде эрозии сетчатого материала.
Цель исследования: оценить эффективность использования ММСК в комплексе с биологическим и синтетическим материалами in vitro и in vivo при десценции тазового дна.
Материалы и методы. Исследование проведено с разрешения Этического комитета ФГБОУ ВО БГМУ (протокол № 10 от 13.11.2017). В эксперименте использовали 72 крысы Sprague Dawley 10-недельного возраста массой 200 г. Анестезию и послеоперационную анальгезию выполнили в соответствии с международными стандартами. Все процедуры соответствовали требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.
Всем крысам осуществлено механическое повреждение задней стенки влагалища, при восстановлении которой использовали викрил 3-0. Животные были разделены на 4 группы по 18 особей. Крысам первой и второй групп на 2-е и 4-е сутки рану обкалывали ксенотрансплантатом (биопластический коллагеновый материал) и аллотрансплантатом (аллопластический материал). В отношении животных третьей группы использовали ММСК (5000 клеток), полученные из жировой ткани крыс, в объеме 1,5 мл. В четвертой, контрольной, группе, никакой биологический материал не применяли.
В послеоперационном периоде животных ежедневно обследовали в течение первой недели, а затем 3 раза в неделю с целью оценки поэтапного заживления влагалища, степени болевого синдрома и выявления возможных осложнений. Животных выводили из опыта на 7-е, 14 и 30-е сутки. Для получения материала с целью морфологической оценки проводили максимальное иссечение стенки влагалища диаметром 1,5–2 см. Биоптаты фиксировали 10%-ным раствором формалина, обрабатывали в парафине, делали срезы, окрашивали гематоксилином, эозином и по Ван-Гизону. По срезам оценивали степень регенерации, признаки продолжающихся процессов ремодуляции (созревания), а также степень патоморфологических изменений.
На втором этапе эксперимента использовали образец липоаспирата подкожной жировой ткани пупочной зоны женщины с дисплазией соединительной ткани (возраст 36 лет, по классификации POP-Q III–IV стадий пролапса). Для экстракции ММСК использовали комплексную методику механической и ферментативной обработки липоаспирата. Жировую ткань помещали в центрифужные пробирки, доливали равный объем фосфатного буфера (DPBS без Ca и Mg; «Биолот», Россия) и центрифугировали 4 мин при 2500 об/мин. После удаления пленки масла жировую ткань механически обрабатывали, пропуская через шприц без иглы. Полученную массу переносили в новые пробирки, добавляли DPBS 1:1 и коллагеназу I типа («ПанЭко», Россия) до концентрации 40 ЕД/мл и инкубировали на шейкере-инкубаторе 1 ч при 37°С. Суспензию центрифугировали 4 мин при 2500 об/мин и добавляли к осадку аммонийный буфер до 4 мл для лизиса эритроцитов и повторно центрифугировали 4 мин при 2500 об/мин. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640 («Биолот», Россия), содержавшей 20%-ную эмбриональную телячью сыворотку (FBS, «Biowest», Франция) и 40 ЕД/мл гентамицина. Клетки подсчитывали на автоматическом счетчике TC20 («BioRad», США) и рассевали в культуральные флаконы с плотностью 4∙104 на 1 см2. Клетки помещали в инкубатор при 100%-ной влажности и содержании 5% CO2. Через 48 ч не прикрепившиеся клетки удаляли и заменяли среду на новую. Клетки пассировали до достижения 70–80% конфлюэнтности. Для эксперимента использовали клетки 4–5-х пассажей. Клетки снимали с подложки с помощью раствора трипсина-ЭДТА 0,25% («ПанЭко», Россия), подсчитывали и рассевали по 1,25∙105 клеток в 50 мкл среды в лунки 24-луночного планшета с неадгезивной поверхностью, в который предварительно были помещены кусочки сетки площадью 1 см2. Всего было подготовлено по 9 лунок: без нанесения клеток; с клетками на сетке; с клетками, нанесенными на предварительно обработанную аллотрансплантатом монофиламентную полипропиленовую сетку соответственно. Через 4 ч добавляли по 200 мкл среды в каждую лунку и инкубировали клетки в течение 3 сут. Для регистрации результатов живые клетки фотографировали с использованием метода фазового контраста на микроскопе Carl Zeiss Axio Observer D1 и камеры AxioCam MRc5 («Carl Zeiss», Германия). Суспензию аллотрансплантата в объеме 2–2,5 мл наносили на неадгезивную для клеток полипропиленовую поверхность планшета и сшивали с использованием светодиодной стоматологической лампы (460 нм, 1200 мВт/см2, 3M Epilar Free Light 2) в течение 30 с.
Результаты. Выраженные воспалительные процессы, развившиеся в зоне механического повреждения слизистой влагалища экспериментальных крыс, без лечения приводили к формированию в зоне собственной соединительнотканной пластинки нефункциональной, очень плотной, бессосудистой, грубой рубцовой ткани вместо характерной для нормы хорошо васкуляризированной рыхлой соединительной ткани. Рубцовая зона была покрыта неравномерным слоем многослойного плоского эпителия с акантозными врастаниями. Влагалищные складки, обычные для растяжимой эластичной слизистой влагалища в норме, отсутствовали (рис. 1).
На 7-е сутки после применения ксенотрансплантата рана эпителизировалась. Интенсивность воспалительных процессов в глубоких слоях слизистой вокруг биоматериала была гораздо менее выраженной, чем в контрольной группе. Наиболее выраженной воспалительная реакция была на 14-е сутки, непосредственно вокруг введенного материала. Под эпителием формировалась васкуляризированная грануляционная ткань, которая постепенно созревала в довольно плотную соединительнотканную пластинку слизистой. Хотя в ней и определялось небольшое количество функционирующих сосудов, структурно она была близка к рубцовой ткани. Эластичностью, присущей обычно рыхло организованной и хорошо васкуляризированной собственной пластинке слизистой влагалища в норме, на 30-е сутки сформировавшийся регенерат из плотной соединительной ткани обладать не мог, поэтому и не формировал влагалищные складки. Таким образом, ксенотрансплантант не приводит к полноценной регенерации тканей, но по сравнению с контрольной группой (без лечения) способствует быстрой эпителизации и снижает степень воспалительной реакции в ране при регенерации соединительной ткани (рис. 2).
Использование низкоантигенного аллотрансплантата после механического повреждения слизистой влагалища у крыс вызывало относительно слабое воспаление. Аллотрансплантат привлекает большое количество в основном макрофагов, которые фагоцитируют не только частицы биоматериала, но и раневой детрит, тем самым помогая быстро очистить рану и запустить процессы регенерации.
К 14-м суткам у экспериментальных крыс второй группы на месте механической раны определялись почти полностью восстановившиеся ткани слизистой влагалища без выраженных патоморфологических изменений. Ткани слизистой отличались от нормы только присутствием в глубоких слоях соединительнотканной пластинки умеренно повышенного количества клеточных элементов – фибробластов, гистиоцитов, малодифференцированных фибробластоподобных клеток, небольшого количества лимфоцитов. Это служит признаком продолжающихся процессов ремодуляции (созревания) новообразованной соединительной ткани. Эпителиальный слой в зоне повреждения слизистой влагалища крыс имел равномерную толщину. Обращали на себя внимание формирующиеся влагалищные складки слизистой (рис. 3).
На 30-е сутки после введения аллотрансплантата поврежденная слизистая оболочка влагалища крыс на гистологических препаратах выглядела почти интактной. Влагалищные складки хорошо просматривались. Поверхность слизистой оболочки влагалища была покрыта многослойным плоским эпителием. Эпителиальный слой лежал на собственной соединительнотканной пластинке, представленной рыхлой васкуляризированной соединительной тканью. Далее определялись более рыхлая подслизистая оболочка с большим количеством кровеносных сосудов и мышечный слой.
Таким образом, использование аллотрансплантата приводит к быстрой и полной эпителизации раны и формированию структурно полноценной соединительнотканной пластинки слизистой оболочки влагалища.
После использования ММСК у большинства крыс на 7-е сутки рана эпителизировалась и под ней обнаруживалась грануляционная ткань. На 14-е сутки тонкие фибриллы в грануляционной ткани складывались в более грубые пучки, количество кровеносных сосудов уменьшалось, часть из них редуцировалась. Грануляционная ткань под эпителием становилась плотнее, она подвергалась созреванию (процессам ремодуляции).
На 30-е сутки слизистая оболочка влагалища в зоне повреждения на гистологических препаратах выглядела практически интактной. Сверху она была покрыта многослойным плоским эпителием, под которым определялась собственная соединительнотканная пластинка, представленная рыхлой васкуляризированной соединительной тканью, хотя по сравнению с предыдущей опытной группой пучки коллагеновых волокон были толще и грубее, а кровеносных сосудов в ней было меньше. Эластичность ткани, вероятно, восстанавливалась, так как влагалищные складки в данной области формировались.
Таким образом, введение ММСК приводило к полной эпителизации раны и формированию структурно полноценной соединительнотканной пластинки слизистой и подслизистой оболочки, но с несколько меньшим количеством, чем при использовании биоматериала во второй группе, кровеносных сосудов в них.
На втором этапе эксперимента проводили оценку совместимости сетчатого протеза с ММСК и аллотрансплантатом in vitro.
Плотность распределения ММСК сразу после посева на планшет оказалась практически одинаковой в лунках с аллотрансплантатом и без него (рис. 4). Таким образом, плотность посева не могла оказать влияние на дальнейший рост клеток в течение 3 сут.
Морфология ММСК в лунках с неадгезивной поверхностью отличалась меньшей площадью, занимаемой отдельной клеткой, и меньшим числом отростков у каждой клетки. Кроме того, клетки легко отделялись от подложки при любом механическом воздействии, оставаясь скрепленными между собой (рис. 5).
При культивировании клеток в присутствии только фрагмента сетчатого протеза наблюдалась слабая адгезия клеток к полипропиленовой подложке планшета. К 4-м суткам ММСК сформировали в основном по одному фокусу в каждой лунке планшета, который состоял из плотно прикрепленных друг к другу клеток практически без отростков, образующих крупную глобулярную структуру. Каждый такой фокус окружал элемент сетчатого протеза (рис. 6).
После культивирования ММСК в течение 4 сут. в присутствии фрагмента сетчатого протеза и аллотрансплантанта наблюдалось относительно равномерное распределение клеток вокруг петель сетчатого протеза. Клетки формировали отростки и образовывали многослойные, напоминающие мелкую сеть структуры. Слои с хорошо различимыми клетками могли включать элементы сетчатого протеза, скрепляясь с ним за счет контактов между ММСК (рис. 6).
Таким образом, фиксация ММСК к монофиламентному полипропилену не происходит на 4-е сутки ни в присутствии аллотрансплантата, ни без него. Использование сетчатого протеза, аллотрансплантанта и ММСК способствует образованию единого комплексного биологического материала in vitro. Аллотрансплантант служит матрицей для направленного и равномерного роста слоя ММСК, а сетчатый протез обеспечивает поддерживающую функцию и механическую прочность этого слоя. Это может усиливать противовоспалительное действие.
Результаты нашего исследования показывают, что введение ММСК в комбинации с аллотрансплантатом может приводить к снижению воспалительной реакции хозяина на сетчатый протез (монофиламентная полипропиленовая сетка) за счет резорбции биоматериала, повышения активности макрофагов и замещения его рыхлой соединительной тканью с развитым капиллярным руслом без признаков рубцевания. Несмотря на то что прочность материала синтетической сетки достаточна для восстановления целостности ткани, для снижения ответной реакции требуются дополнительные материалы, способствующие морфологическим изменениям в зоне проведенной операции. В настоящее время в клинической практике не используются широко сетки с полипропиленовой или полиэфирной основой, покрытые защитной мембраной для предотвращения деформации ткани или образования свища [5]. Однако, ограничивая взаимодействие сетки с тканью, можно повысить эффективность окончательного восстановления.
Несмотря на многообещающие результаты, данное исследование имеет несколько ограничений. Мы использовали биологическую модель грызунов и небольшой размер экспериментальных групп, чтобы продемонстрировать разницу в эффективности интраоперационного применения различных материалов. Будущие исследования будут направлены на подбор эффективного объема ММСК и биоматериалов в более крупных группах модельных животных. Кроме того, планируется применение комбинаций полимерных и биологических материалов in vivo с более длительным наблюдением для анализа процесса регенерации.
Заключение. Это пилотное экспериментальное исследование продемонстрировало, что ММСК непосредственно взаимодействуют с аллотрансплантантом в отличие от синтетических материалов. Поскольку аллотрансплантат является биологическим материалом и обеспечивает полноценную регенерацию, он может оказаться полезным при восстановлении тазового дна в комбинации с сетчатым протезом. Учитывая относительно низкую себестоимость, аллотрансплантат обладает большим потенциалом в комбинации с сетчатым протезом.
В наших исследованиях все крысы имели соответствующую прибавку в весе и не имели признаков системного воспаления после имплантации, что указывает на биосовместимость данных материалов. Мы не наблюдали каких-либо клинических признаков инфекции или развития отторжения в течение периода имплантации. Таким образом, использование аутологичных ММСК в сочетании с аллотрансплантатом и сетчатыми полимерными материалами для реконструкции тазового дна может значительно улучшить результаты реконструктивных операций.
